桦褐孔菌多糖的提取工艺优化及对人肝癌细胞HepG2脂肪堆积的影响

2019-07-08 03:30:59 江苏农业科学2019年10期

张蕾 郝婧玮 宛春雷 柴军红 赵玥 王鑫 王雪

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摘要:通过L9(34)正交试验,通过MTT法选取桦褐孔菌多糖对HepG2细胞的安全浓度,检测不同浓度的桦褐孔菌多糖对胞内TG蛋白的影响,及桦褐孔菌多糖减轻细胞内脂质堆积的作用。结果表明,桦褐孔菌多糖最佳条件为 1 g ∶ 15 mL 的料液比,在温度30 ℃下提取30 min,超声功率为480 W。桦褐孔菌多糖可明显减轻HepG2细胞内脂质堆积,显著降低细胞中TG的含量,其中600 mg/L桦褐孔菌多糖对TG的清除率达24.57%,脂滴数量明显减少。说明桦褐孔菌多糖具有良好的体外降脂活性,对脂肪肝有较好的预防效果。

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关键词:桦褐孔菌;多糖;HepG2细胞;甘油三酯;脂肪堆积;清除率;脂滴数量

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中图分类号: R284  文献标志码: A  文章编号:1002-1302(2019)10-0201-04

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非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的主要特征是肝细胞内脂肪的变性以及脂质的贮积,但同时无过量饮酒史的临床病理综合征[1]。经常伴有中心性的肥胖、高血脂症,对胰岛素的抵抗能以力及对糖的耐量异常等方面代谢综合征,严重危害人类的健康[2-4]。近年来,对NAFLD的研究很多,但对其发病机制的研究尚不清楚。因此,寻找到有效治疗NAFLD的药物非常重要。

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桦褐孔菌(Phaeoporus obliquus J. Schroet),别称白桦茸,被赞誉为“西伯利亚灵芝”,为真菌门担子菌亚门层菌纲非褐菌目多孔菌科褐卧孔菌属,是一种非常珍稀而名贵的药用真菌,生长在温度相对较低的俄罗斯西伯利亚地区的原始森林中,不能人工栽培,非常稀少,颜色呈深栗色,常在树皮破损及伤节处形成肉瘤状菌核,菌块性状为近球形或不定形块状;研究发现,其化学成分包含多糖类化合物、芳香物质、多酚类化合物、三萜类化合物等物质[5-8],具有重要的药用价值。从16世纪至今,桦褐孔菌一直被作为一种民间药物来治疗糖尿病、高血压、抗衰老等,具有显著的效果[9-10]。对于非酒精性脂肪肝病的治疗,目前还尚未见相关的研究报道。本试验通过模拟临床上NAFLD的病理特点,通过优化提取桦褐孔菌多糖提取物,将其作用于HepG2细胞,从细胞水平上来评价桦褐孔菌多糖提取物对细胞脂质堆积的影响,以及对细胞内甘油三脂含量的影响,从而揭示其在防治非酒精性脂肪肝方面的药用价值。

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1 材料与方法

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1.1 试剂与仪器

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桦褐孔菌购于黑龙江省绥芬河市;MTT、TG试剂盒、油酸、油红O和细胞裂解液购于上海源叶生物科技有限公司;DMEM细胞培养基、血清、胰蛋白酶等细胞试剂购于Hylone公司;乙醇、异丙醇购于北京化工厂;HepG2细胞笔者所在实验室传代保存,由哈尔滨工业大学赠送;粉碎机(戴声设备有限公司)、超声波清洗机(杭州法兰特超声波科技有限公司,总功率800 W)、电子天平(QUINTIX224-1CN Sartorius,R210)、旋转蒸发仪(瑞士BUCHI)、电子显微成像系统(CX31 Olympus)、酶标仪(Synergy HTX BioTek)、静音混合器(MT-360其林贝尔)。

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1.2 桦褐孔菌多糖的提取及测定

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将桦褐孔菌粉末过筛,准确称取5 g溶于醇浓度为30%的乙醇中,在一定时间、温度、料液比和超声波功率下振荡处理一定时间,用80%乙醇沉淀多糖后,4 000 r/min,离心 7 min 后取上清液,减压浓缩至浸膏后水浴至干,得粗制多糖,标准曲线法测定其含量。

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1.2.1 单因素试验指标对桦褐孔菌多糖提取量的影响 设计桦褐孔菌多糖提取物单因素试验的变量条件分别为:提取温度,20、30、40、50、80 ℃;提取时间,10、20、30、40、50 min;料液比1 g ∶ 8 mL、1 g ∶ 10 mL、1 g ∶ 15 mL、1 g ∶ 20 mL、1 g ∶ 25 mL;超声功率,160、320、400、480、640 W,从而来确定正交试验中各因素的水平。

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1.2.2 提取工艺正交试验优化 在单因素试验基础上,利用正交试验表L9(34)进行正交试验,各因素与水平见表1。

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1.3 细胞培养及MTT法测HepG2细胞活性

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复苏HepG2细胞,将实验室冻存的HepG2细胞从液氮罐中取出,迅速放于37 ℃水浴锅中融化,用PBS清洗后,1 000 r/min 离心去上清后将其放于含10% FBS的DMEM培养基中,培养条件:温度为37 ℃、体积分数为5%的CO2、饱和湿度,将培养好的HepG2细胞每隔1 d进行传代培养,并将取处于对数生长期的细胞转于10% FBS的高糖型DMEM培养基进行下一步试验。

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将处于对数生长期的HepG2细胞接种于96孔细胞培养板中,并利用细胞计数板记数使每孔细胞的接种量达到104个,置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育24 h后,设对照组和给药组(桦褐孔菌多糖提取物),给药组的终浓度分别为6、60、600、6 000、60 000 mg/L,每组设置3个平行孔,培养24 h;每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL,继续在37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养4 h;取出,缓慢吸去培养液,然后每孔加入100 μL的DMSO,振荡5~10 min;酶标仪 490 nm 处测吸光度。根据酶标仪的吸光度值计算细胞存活率,选择存活率达到70%以上时的桦褐孔菌多糖浓度为安全浓度。

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1.4 细胞内TG

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检测蛋白吸附法[11],桦褐孔菌多糖的给药浓度分別是600、60、6 mg/L,细胞内的TG含量检测方法同陈静等对细胞内TG浓度的测量[12]。

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TG清除率=(D模型-D给药)/D模型×100%。

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1.5 油红O染色

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油红O工作液配制:首先配制0.5%油红O储备液,将油红O粉末溶于异丙醇中,储备液用蒸馏水稀释后过滤2次,至液体澄清为止[13]。

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将HepG2细胞接种于24孔板,37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中孵育24 h后取出,分为对照组、模型组、低中高浓度(600、60、6 mg/L)桦褐孔菌多糖给药组,各组所加培养基。孵育24 h后用油红O工作液染色30 min,蒸馏水吹洗2次,在倒置显微镜下观察染色效果。

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1.6 统计分析

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通过SPSS 13.0软件对数据进行分析。

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2 结果与分析

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2.1 提取时间、超声功率、提取温度、料液比分别对桦褐孔菌多糖提取率的影响

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通过对比分析分别改变提取时间、超声功率、提取温度、料液比条件下桦褐孔菌多糖类物质的提取率,结果分别显示,提取时间为30 min、超声功率为320 W、提取温度为40 ℃、料液比达到1 g ∶ 15 mL时,桦褐孔菌中的多糖提取量最大(图1)。因此,选择提取时间20~40 min 、超声功率240~400 W、提取温度30~50 ℃、料液比1 g ∶ (10~20) mL为进一步优化。

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2.2 桦褐孔菌多糖类物质提取的正交优化试验

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通过正交试验确定桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺。正交试验结果表明,影响桦褐孔菌多糖类物质提取率的因素主次顺序为D>A>B>C,即超声功率和超声时间对桦褐孔菌多糖提取效果影响相对较大,其次为提取温度、料液比的影响。综合以上条件,桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为A2B2C1D3,即按1 g ∶ 20 mL的料液比在温度30 ℃下提取30 min,超声功率为480 W,乙醇浓度为30%进行多糖含量测定(表2)。

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通过对正交试验结果进行方差分析,來分析各因素对多糖提取率的影响。结果表明,提取时间、功率、温度和料液比对提取率影响显著(表2)。

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2.3 桦褐孔菌多糖的细胞毒理学评价

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高浓度的药物对细胞具有一定的毒性,为了避免此情况的发生,本试验通过MTT法检测桦褐孔菌多糖对细胞存活率的影响,选取对细胞毒害作用较小的多糖作为给药剂。如表3所示,桦褐孔菌多糖浓度为6 mg/L时,细胞的存活率为9302%;浓度为60 mg/L时,细胞的存活率为80.04%;浓度为600 mg/L时,细胞的存活率为68.75%;浓度为6 000 mg/L时,细胞的存活率为38.06%;浓度为60 000 mg/L时,细胞的存活率为25.32%。随着桦褐孔菌多糖浓度的增加,HepG2细胞的死亡率也在升高,说明桦褐孔菌多糖对细胞有一定的毒害作用。当浓度在600 mg/L以下时,对细胞毒害作用相对小。因此,将桦褐孔菌多糖的给药浓度可设定在6~600 mg/L 之间的安全浓度范围内(表3)。

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2.4 桦褐孔菌多糖对HepG2细胞TG含量的影响

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为了减少高浓度的桦褐孔菌多糖对细胞的毒害作用,试验选取了600 mg/L以下的桦褐孔菌多糖浓度,测定不同浓度对HepG2细胞脂肪堆积模型TG含量的影响。表4所示,模型组与对照组相比,TG含量显著增加(P<0.05),表明HepG2细胞脂肪堆积模型成功建立[12]。60 mg/L桦褐孔菌多糖组与模型组相比,TG含量具有显著性差异(P<0.05);600 mg/L桦褐孔菌多糖组与模型组相比,TG含量具有显著性差异(P<0.01),并随桦褐孔菌多糖浓度的升高,TG的清除率也逐渐升高,具有明显的剂量依赖性,其中高浓度组 600 mg/L 桦褐孔菌多糖对细胞内TG的清除效果最好,其清除率达到24.57%。

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2.5 桦褐孔菌多糖减轻细胞内脂质堆积的作用

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桦褐孔菌多糖对油红O染色的细胞形态学影响见图2,与对照组相比,模型组细胞内出现大量的红色脂滴,同时伴随相互融合现象,说明试验成功建立了细胞脂肪堆积模型[12],并随着桦褐孔菌多糖浓度的提高,HepG2细胞内红色脂滴数目逐渐减少,且脂滴变小。在3个浓度桦褐孔菌多糖给药组中,低浓度给药组的作用效果不明显;与模型组相比,中浓度给药组对细胞内脂质堆积稍有改善,明显减轻了细胞内脂质相互融合的现象;高浓度给药组可明显减轻细胞内脂质堆积现象,且脂滴数目显著减少,这与陈静等研究人参多糖Rb1对HepG2细胞脂肪堆积影响结果[12]相似。本试验结果说明桦褐孔菌多糖对体外降脂有一定的作用效果。

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3 讨论与结论

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非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的发病率呈现逐年上升的趋势,已经成为一种严重危害人类健康的世界性疾病。NAFLD是导致肝功能异常的主要原因,肝脏脂肪积聚是其典型特征,但并不能用单一的机制来解释其发病的机制。TG是NAFLD患者肝脏内蓄积的主要脂质,是由体内TG合成与转化失衡的结果[13]。

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HepG2细胞已经被成功用于脂肪肝细胞模型的建立,且长链脂肪酸能够使HepG2细胞内形成明显的脂滴,进而引起细胞内脂肪的堆积。因为游离脂肪酸中含量最高的是油酸,所以选择油酸来诱导建立肝细胞脂肪堆积模型,是符合NAFLD形成的病理生理过程的[14]。因此,本试验采用以上诱导方法,在单因素的基础上通过正交试验得到桦褐孔菌多糖的最佳提取条件,将提取的桦褐孔菌多糖提取物作用于HepG2细胞,并选择NAFLD的常规检测指标来评价桦褐孔菌多糖对细胞内脂肪堆积的作用效果。试验结果表明,600 mg/L 桦褐孔菌多糖组的效果最显著,TG含量与模型组比较差异极显著(P<0.01),对细胞内TG的清除率可达

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2457%,并且具有剂量依赖性。说明桦褐孔菌多糖提取物具有一定的清除细胞内脂肪堆积的作用,推测其在脂肪肝治疗方面也具有潜在的药用价值,但目前对于桦褐孔菌多糖降脂机制还不明确,具体的降脂机制还有待于进一步研究。

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  1. 1《读者》2019年5期

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  2. 2《视野》2019年15期

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  4. 4《恋爱婚姻家庭·青春》2019年8期

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  5. 5《意林·少年版》2019年14期

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